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Na primeira metade do século XVIII, depois de derrotarem os Manao e os Mayapena, que dominavam o Baixo e Médio Rio Negro e que haviam sido anteriormente seus colaboradores, os portugueses conseguiram alcançar a região do Alto Rio Negro e de seus principais afluentes, como o Uaupés, o Içana e o Xié, ainda muito povoados e praticamente não atingidos pelos brancos. Nesse período, os Carmelitas instalaram aldeamentos até o Alto Rio Negro, nas proximidades da atual cidade de São Gabriel da Cachoeira. O comércio de escravos ficou tão intenso nos anos de 1740 que estima-se que até meados do século XVIII cerca de 20 mil índios foram apresados e descidos do Alto Rio Negro. Nas listas dos escravos retirados dessa região, já estão incluídos em grande número índios Tukano, Baniwa, Baré, Maku, Werekena e outros que vivem hoje em dia nesta mesma área, trazidos para trabalhar em Belém e São Luís.

Em conseqüência do contato com os portugueses, uma epidemia de varíola devastou o Alto Rio Negro em 1740, matando grande número de índios, pois é muito provável que ela tenha se alastrado por certas partes da região sem contato direto com os "brancos", por meio de tecidos e roupas de algodão. Entre 1749 e 1763, epidemias recorrentes de varíola e sarampo continuaram assolando a região, sendo que a de sarampo de 1749 foi tão terrível que passou a ser chamada "o sarampo grande".

A revolta indígena mais famosa desse período foi a de 1757, liderada pelos principais de Lamalonga no Médio Rio Negro. Esta rebelião marca a revolta dos índios contra os missionários, pela ênfase dada à destruição das igrejas e paramentos religiosos e o assassinato do padre carmelita.

Na segunda metade do século XVIII, o governo português sob a direção do Marquês de Pombal retirou o "poder temporal" dos missionários. Eles perderam o controle da administração das aldeias, que então passaram a ser dirigidas por colonos, civis ou militares, que também ganharam o título de "diretores dos índios". Os missionários foram, todavia, autorizados a ficar nos povoados para prosseguir o trabalho de catequese e convencimento dos índios das cabeceiras dos rios e dos igarapés a virem se instalar nessas aldeias do Médio e Baixo Rio Negro. Ainda assim, ocorreu um sensível declínio do trabalho missionário. As aldeias mais prósperas foram elevadas à categoria de povoados ou de vilas, recebendo um nome português, muitas vezes o de um santo. A lei pombalina queria colocar um fim à escravidão e promover a assimilação dos índios à sociedade colonial.

O Marquês de Pombal queria dar aos índios os mesmos direitos dos europeus, mas logo entendeu que os colonos dependiam, para sobreviver, do trabalho indígena, tanto para a agricultura como para a extração das drogas de sertão. Instituiu um sistema de trabalho segundo o qual uma parte dos homens de boa saúde trabalharia vários meses por ano na construção de casas nas vilas coloniais, ao passo que os outros cuidariam das plantações. Mas esse sistema de regulação do trabalho não foi respeitado e os índios continuaram sendo explorados pelos colonos. Centenas deles foram levados para as vilas coloniais durante esse período.

Com base nas fortalezas construídas em 1763 (São Gabriel e São José de Marabitanas), exploradores militares portugueses fizeram exaustivas viagens pelos afluentes superiores do Negro, uma região estratégica, por estar situada na faixa de fronteira entre os impérios coloniais de Portugal e Espanha, sobretudo após a assinatura, em 1750, do Tratado de Madri.

Para os povos indígenas, esse período significou o devassamento quase completo de seu território pelos militares portugueses, e também o aumento da depopulação das aldeias em decorrência dos "descimentos", uma forma de escravidão velada que levava os índios ao trabalho nas embarcações e na agricultura. Essa política teve alto custo para os portugueses, pois ocasionou muitas fugas e revoltas de índios aldeados, havendo sempre a necessidade de reposição de braços para a lavoura de anil e mandioca e para o trabalho de coleta de cacau.